توليد كاست‌ القايي-RNAi گياهي بروش PCRتك‌چرخه‌اي مبتني بر جفت آغازگرهايي با قابليت تشكيل ʹ3-ديمر و طي همسانه‌سازي دو مرحله‌اي جهت خاموشي بيان ژن گياهي در زمينه بيوتكنولوژي گياهي و مهندسي ژنتيك. در سال‌هاي اخير، اهميت فناوري RNAi در كنترل بيان ژن‌هاي گياهي منجر به معرفي روش‌هاي متعدد جهت همسانه‌سازي كاست‌هاي RNAi اختصاصي گرديده‌ است. ليكن، تعدد مراحل همسانه‌سازي، اتكا به روش‌هاي مبتني بر PCR، كاهش راندمان، افزايش هزينه و اتلاف زمان از جمله اهم محدوديت‌هاي اين روش‌ها مي‌باشند. در ابداع حاضر، siRNAهاي مستعد با روش‌هاي بيوانفورماتيكي در توالي mRNA ژن هدف شناسايي شده و به صورت يك توالي يكپارچه در مجاورت يكديگر جايگذاري مي‌گردند. سپس، جفت آغازگرهايي با قابليت تشكيل ʹ3-ديمر (≥9 نوكلئوتيد) و امكان پوشش كامل توالي siRNAهاي منتخب طراحي شده و قطعات inverted repeats به روش one-step PCR تكثير مي‌شوند (شكل1). همسانه‌سازي كاست القايي-RNAi طي دو مرحله‌ شامل TA-cloning قطعه direct-repeat در يك T-vector و به دنبال آن sub-cloning قطعه inverted-repeat همسانه‌سازي انجام مي‌گيرد. بطوريكه، بخشي از توالي T-vector به عنوان ناحيه فاصله‌دهنده در كاست ملحوظ مي‌شود (شكل2). اين ابداع در تمامي مراكز تحقيقاتي فاقد امكانات پيشرفته و توسط افراد متخصص يا مبتدي فعال در زمينه توليد گياهان GM توسط فناوري RNAi، قابل بهره‌برداري است.

‏خلاصه ‏وكتور دوگانه pNM106 ‏براي فوق تظاهر و خاموشي ژن ها در گياهان ‏با كامل شدن توالي يابي ژنوم بسياري از موجودات، آناليز سيستماتيك و وسيع ژنوم گياهان، براي عملكرد ژن ها امكان پذير شده است. همسانه سازي ژن، اولين قدم در بررسي عملكرد ژن محسوب مي شود و وكتورهاي دوگانه از ابزارهاي بسيار مهم هم در اين بررسي به شمار رفته و همچنين براي انتقال ژن به گياهان با اهداف مختلف مانند تعيين نقش ژن و يا توليد يك فرآورده مورد استفاده قرار مي گيرند. جايگاه هاي برشي در . M.C.S ‏وكتورها بسيار محدود بوده و همسانه سازي زن هاي هدف را دچار مشكل مي كند. وكتورهاي TIA ‏نمي توانند به منظور همسانه سازي ژن براي بيان گذرا و يا پايدار مورد استفاده قرار بگيرند، زيرا چالش هاي تكنيكي توليد وكتورهاي TIA ‏و مختص باكتري بودن آن ها مانع از اين كار مي شود. استفاده از سيستم Gateway ‏نيز به دليل دو مرحله اي بودن آن و گران بودن مواد لازم براي انجام واكنش ها، همسانه سازي بزرگ مقياس را به ويژه زماني كه كلون هاي entry ‏هم در دسترس نباشه، غير اقتصادي مي باشد. وكتور pNMI06 ‏معرفي شده در اين اظهارنامه اختراع، انعطاف پذيري زيادي در انتخاب جايگاه برش دارد و همسانه سازي جهت دار را تسهيل مي نمايد و همچنين نسبت به وكتور pBll21 ‏كه يك وكتور معمول در آزمايشگاه هاي مهندسي ژنتيك مي باشد، تا ١٠ ‏برابر قدرت تظاهر بيشتري دارد، چرا كه علاوه بر راه انداز 355 ‏، داراي افزاينده 355 ‏نيز مي باشد. مزيت ديگر اين وكتور در همسانه سازي همزمان و تك مرحله اي زن به صورت سنس و آنتي سنس مي باشد. در اين وكتور محصول PCR ‏كه داراي ك آدنين در دو انتهاي ٣ ‏خود مي باشد، مي تواند در يك مرحله به صورت مستقيم و با هضم انزيمي در جايگاه ! Sac ‏اين وكتور كلون شود كه يكي از مزيت هاي جديد، منحصر به فرد و نواورانه ي اين وكتور به شمار مي رود.

‏خلاصه ‏وكتور دوگانه 08 ‏! pNM ‏براي فوق تظاهر ژن MdSOCJa ‏در گياهان ‏به كار گيري روش ها و فنون مهندسي ژنتيك و بيوتكنولوژي در اصلاح درختان ميوه به ويژه سيب كه از جنبه هاي اقتصادي و غذايي اهميت فوق الاده اي دارد، بسيار ارزشمند است. اين فن آوري امكاناتي را فراهم مي كند كه با روش هاي سنتي (كلاسيك) امكان پذير نيست. مهندسي ژنتيك گياهي با ابزاري به نام وكتور يا حامل ميسر مي شود كه حاوئ ژن مورد نظر جهت انتقال به ژنوم گياه مي باشد. با توجه به اين كه وكتور مورد ٠ ‏نظر در اين ادعا نامه حاوي توالي سنس ژن MdSOCla ‏تحت كنترل راه انداز 355 CaMV ‏انجام مي گيرد، مي تواند بعد از انتقال به گياهان مدل و نيز درختان ميوه به ويژه سيب باعث تسريع گل دهي و كوتاه كردن دوره ‏نونهالي شود. همچنين با توجه به نوع راه انداز به كار رفته يعنيcamv35s كه يك راه انداز قوي و دائمي ‏بيان در گياهان است، در اين وكتور در مقايسه با ساير راه اندازها مثل دابل CaMV 3SS ‏انتظار تظاهر بسيار زياد نمي رود. همچنين، زمينه اين وكتور مربوط به يك وكتور مشهور به نام pBil21 ‏مي.باشد كه در تحقيقات بسياري مورد استفاده قرار گرفته و كارايي خود را بويژه در تراريخت كردن درختان ميوه منجمله سيب نشان ‏داده ‏است و اين مزيتي ديگر براي وكتو، 08 ‏! pNM ‏محسوب مي شود ٠ ‏.